拉咪呋定治疗前后乙型肝炎病毒YMDD变异株的演变

　　拉咪呋定是的抗乙型肝炎病毒(HBV)物，已在临床广泛应用，但可因YMDD变异而耐。对拉咪呋定的耐机制，外学者从不同的角度进行了：有些学者认为拉咪呋定治疗过程中出现YMDD变异后HBV多聚酶的结构发生改变，与拉咪呋定的结合能力下降而致它的耐；而且在未进行拉咪呋定治疗的患者的血清中检测出YMDD变异株，但未见拉咪呋定治疗患者的病毒株组成分析的报导。本文克隆分析了拉咪呋定治疗前和治疗48W时病毒株的变化与临床之间的关系，进一步探讨拉咪呋定的耐机制。
　　
　　材料与方法
　　
　　1.患者与血清标本：根据00年传染病与寄生虫病会议修订的病毒性肝炎防治方案，5例郑州地区慢性HBV感染者(表面抗原阳性，斑点法阳性，病程6个月以上)用拉咪呋定0mz/日口服治疗，治疗48W时HBV PCR仍阳性，选择治疗前与治疗48周的血清标本进行分析。
　　
　　2.方法
　　
　　2.1  HBV血清标志及核酸检测：血清中乙型肝炎病毒表面抗原/抗体(HBsAg/HBsAb)及乙型肝炎病毒e抗原/抗体(HBeAg/HBeAb)用微粒酶方法检测(Axsym，Abbett，USA)，HBV 用斑点杂交法(治疗前)和b信号扩增法(治疗过程中)检测。
　　
　　2.2  血清HBV 的抽提与扩增：蛋白酶K裂解，酚、氯仿抽提，酒精沉淀。扩增包括YMDD区域在内的片段长度为0bP，引物为S2(5’—TATGTTGCCCGTTTGTCC—3’，nt462-481)，AIT(5-CATTCATTGGAAAGTATGTCA3’nt972-994)；扩增条件为：94C5mins变性后循环温度分别为94~Cs，58~Cs、72~C1min，个循环后，72~Cmins延伸，PCR产物进行测序及克隆。
　　
　　2.3  序列分析：由郑州生工公司测序，方法为双脱氧末端终止法，测序引物为S2。
　　
　　2.4  重组质粒的构建：使用Qiagene公司的PCR纯化试剂盒回收PCR产物，详细操作按说明书进行，取纯化好的PCR产物与pGEM—T载体连接，用T：连接酶于15cC反应过夜。转化大肠杆菌DH5a感受菌。每份血清标本各挑—24个单个白色菌斑。
　　
　　2.5  重级质粒PCR鉴定；取上述制备的重组质粒 1：0稀释物lp.1为模板，加人反应体系中，反应条件同上。取PCR产物t.ti进行2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外灯下观察结果。
　　
　　2.6  YMDD病毒株的检测：采用实时荧光PCR方法对克隆株进行YMDD及其变异株检测(已另文)
　　
　　结  果
　　
　　1.阳性克隆的鉴定：重组质粒pGEM—P经特异性引物PCR扩增，电泳观察结果，可见阳性条带，片段长为532bp。证实目的基因(HBV nt462—994)已克隆至载体pGEM—T中。
　　
　　2.YMDD变异检测结果    ·
　　
　　2.1  克隆株：通过实时荧光PCR方法分析5例患者治疗前后IO份标本的克隆(共5株)，YMDD变异株所占比例治疗前分别为.5%、13.64%、8.7%、0.15%，治疗48W时演变为0%、0%、65%、0%、0，比较治疗前后的结果发现：YMDD变异株在分患者中治疗前已存在，但为弱势株，随着治疗时间的延长，弱势株演变为株；由表1所见例1M552工、M552 V所占的比率由治疗前5.25%、5.25%变为
　　
　　4.2%、95.8%，例2由13.64%、0变为5.3%、94.7%，这可能因M552V变异株较M552工变异株复制力更
　　
　　高，易演变为株；第5例患者治疗前检测出M552 V，治疗48W时YMDD为株。   2.2  PCR产物直接测序：分别对5例患者治疗前与治疗48W的标本进行PCR产物直接测序，治疗前的标本均未发现YMDD变异；治疗48W时4例患者出现YMDD变异，其中2例M552 V(例1、4)、2例M5521变异(例2、3)，例5无YMDD变异(测序结果见图1略)。
　　
　　3.YMDD及其变异株动态变化与HBV，ALT之间[FS:PAGE]的关系：在5例患者中HBV (b信号扩增法)、ALT突发2例(例2、3)，HBV 、ALT无突发2例(例1、4)，例5HBV 突发、ALT正常，前4例患者治疗48W均出现YMDD变异，后1例治疗48W未发现有YMDD变异。
　　
　　讨  论
　　
　　拉咪呋定治疗慢性乙型肝炎能使HBV下降、ALT正常、肝脏组织学改善。但是，随着治疗时间的延长，分患者出现YMDD变异，多显示：1年时16%—32%的患者发生耐变异，2年时达到47%-56%，3年时69%—75%，YMDD变异有M552 V、M5521两种。体外实验证明这种变异病毒的复制水平显低于野毒株，但变异病毒对拉咪呋定的敏感性也下降。体外实验证明上述变异同拉咪呋定耐有关。ThiBauh等认为耐变异的出现是由于HBV多聚酶在物的作用下不断选择性调整，使病毒具有较高复制水平。
　　
　　Kobayashi等了未经过拉咪呋定治疗的ALT正常的HBV无症状携带者的YMDD基序的变异情况，对18例患者的血清检测YMDD及其变异株，其中5例患者检测出YMDD变异病毒。本文比较拉咪呋定治疗前后克隆株发现：YMDD变异株在治疗前的血清中已存在，随着治疗时间的延长，YMDD变异株演变为株，这是物筛选，使野毒株减少，变异株获得了增长；我们对YMDD变异株成为株的演变过程与临床的相关性作了初步探讨：出现YMDD变异的患者并不一定有HBV突发或ALT突发，HBV或ALT突发不一定是YMDD变异的结果，第5例患者虽HBV 突发，但无YMDD变异，可能还有其它影响因素如其它位的变异等。
　　
　　同一患者治疗前血清标本通过PCR产物直接测序只能检测出一种病毒株，而它的克隆株通过实时荧光PCR检测则检测出多种病毒株并存，这是因为前者的结果代表株，而后者则可同时反映体内野毒株与变异株。Boucher等在拉咪呋定治疗艾滋病过程中。出现YMDD变异时，发现M5521变异是M552 V变异的中间产物。Niesters等报道了在拉咪呋定治疗慢性乙型肝炎时也可能有这种情况。在本实验中也有类似的结果：有2例患者治疗前病毒株组成均含有M5521，但治疗后M552 V均变成株，出现这种现象的原因可能是由于M522 V变异病毒的复制能力比M5521变异病毒强，而且M552 V变异病毒的结构可能更稳定。
　　
　　总之，在拉咪呋定治疗前患者体内野毒株为株，但已存在少量YMDD变异株，拉咪呋定选择性抑制了野毒林，使YMDD变异株变成株，因此，YMDD变异是物筛选的结果，其中分患者可导致拉咪呋定临床耐；M5521可能是M552V变异的中间产物